✅Сточные воды канализации могут нести важную информацию о COVID-19

Многим известен горнолыжный город Ишгль в Австрии, знаменитый почти 240  километрами живописных трасс. И вдруг он стал также известен по другим событиям...

Так это стало местом одного из первых событий суперпередачи COVID-19. Сотни зараженных лыжников увезли страшный вирус к себе домой и посеяли вспышки по всей Европе.

Однако по мере того, как пандемия прогрессировала, Ишгль был в авангарде по более позитивной причине: чиновники здравоохранения и ученые в штате Тироль были одними из первых, кто контролировал уровни пандемического коронавируса в сточных водах и основывал на них политические решения в области здравоохранения. Поскольку регион настолько зависит от туризма, чиновники стремились узнать, действительно ли вирусная напряженность снижается, чтобы они могли снять ключевые ограничения. Они также хотели поймать самые ранние возможные сигналы о том, что COVID-19 может вернуться. Анализ сточных вод, который собирает фрагменты вируса, пролитые в фекалиях, был неоценимым, говорит Стефан Вильдт, эксперт по сточным водам в департаменте водного хозяйства штата. Следуя примеру Тироля, национальная программа недавно расширилась, чтобы охватить более половины населения Австрии.

Хотя мониторинг сточных вод использовался для отслеживания полиомиелита и других патогенов в течение десятилетий, пандемия COVID-19 привела к взрывному интересу. Метод использует тот факт, что SARS-CoV-2 размножается в пищеварительной системе и проливается в больших количествах, часто до появления известных симптомов болезни. (Вирус также обнаруживается в моче, хотя и не так последовательно.) Это способствует реализации недорогого способа мониторинга инфекции у тысяч или даже миллионов людей без надоедливых мазков из носа или горла, или предсказать, где случаи заражения могут увеличиться. Генетические последовательности вируса сарая также могут дать подсказки о том, как он развивается.

Ученые в Нидерландах, которые десятилетиями имели общенациональную сеть мониторинга сточных вод, были одними из первых, кто показал, что фрагменты вируса SARS-CoV-2 в образцах сточных вод могут точно отражать его уровни в сообществе (см. График ниже). С тех пор проекты мониторинга SARS-CoV-2 возникли по меньшей мере в 58 странах, согласно приборной панели создан Колин Нотон и коллегами из Калифорнийского университета (UC), Мерсед. Европейский союз рекомендовал всем странам-членам создать аналогичные системы мониторинга SARS-CoV-2 к октябрю 2021 года, и 26 из 27 выполнили, говорит Бернд Манфред Гавлик, который помогает координировать усилия через Европейскую комиссию. 

В США Национальная система надзора за сточными водами включает 400 объектов в 19 штатах. В прошлом месяце США Центры по контролю и профилактике заболеваний добавили подобную модель сканирования данных о сточных водах, а 2 марта администрация президента Джо Байдена заявила, что система мониторинга будет частью усилий по обнаружению новых вариантов. В Индии успешный проект в Бангалоре расширяется до полудюжины новых городов. 

Рабочие берут образцы из канализации в Ницце, Франция, в июне 2021 года.МАРК ПЕТЕРСОН/REDUX

Тем не менее, специалисты точно не знают, насколько полезна технология. Надежное определение уровней вирусов в сточных водах создает логистические и технические проблемы, а интерпретация данных может быть затруднена. (Во-первых, сильный ливень приведет к резкому падению концентрации вируса в канализации.) Создание систем сбора, тестирования и отчетности может быть трудоемким и дорогостоящим. И хотя политики приветствовали результаты мониторинга сточных вод, немногие использовали их для принятия мер; как правило, они ждали, пока случаи заболевания возрастут, а отделения интенсивной терапии заполнятся.

Шелеш Агравал из Технического университета Дармштадта, который с 2020 года анализирует пробы воды с участков по всей Германии, говорит, что было трудно убедить политиков, что данные полезны. “Мы курьеры по доставке информации. Мы доставляем её к вашему порогу, но не можем заставить вас ее усвоить”. Даже в Нидерландах, которые могут похвастаться одной из самых сложных систем мониторинга в мире, исследователи признают, что это мало повлияло на национальную политику. Однако местные чиновники использовали голландские данные—например, путем увеличения тестирования в районах, где сточные воды предполагали, что случаи были пропущены.

Однако по мере того, как пандемия смещается, сточные воды могут начать играть большую роль в формировании политики. Многие страны не только снимают пандемические ограничения, но и отказываются от широкого тестирования населения, и все больше людей теперь полагаются на домашние тесты, о которых не сообщается в официальной статистике. Это делает сточные воды ключевым оставшимся инструментом для понимания хода пандемии, говорит Хизер Бишел, эксперт по сточным водам в Калифорнийском университете в Дэвисе: “Это дает более широкую картину”.

ТЕОРЕТИЧЕСКИ ТЕСТИРОВАНИЕ СТОЧНЫХ вод является простым. Как и стандартные клинические тесты, он использует анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) для поиска конкретных фрагментов вирусной РНК в образце, которые затем многократно копируются для усиления сигнала. Количество циклов или раундов копирования, необходимых для обнаружения сигнала в образце, является приблизительной мерой концентрации вируса.

Но в то время как мазок из горла или носа содержит примерно одинаковое количество материала от человека к человеку, образцы сточных вод содержат разное количество фекалий, в зависимости от дня и времени взятия образца, недавних осадков и того, находятся ли туалеты выше по течению в домах, офисах или других зданиях. Все такие переменные должны быть учтены, чтобы иметь возможность точно “прочитать” образец. То, как вода собирается, хранится и обрабатывается, это также влияет на результаты. Все эти переменные очень затрудняют сравнение данных с разных сайтов.

“Некоторые из историй, которые вы читаете, звучат так, будто вы выкапываете воду, погружаете в нее тестовую палочку и получаете ответ”, - говорит Ханна Саффорд, бывшая студентка лаборатории Бишеля в Калифорнийском университете в Дэвисе и эксперт по политике в Федерации американских ученых. “Но это намного сложнее”.

Отслеживание волн пандемии

В Нидерландах, которые могут похвастаться одной из самых сложных систем мониторинга в мире, уровни SARS-CoV-2 в сточных водах довольно тесно коррелируют с зарегистрированными случаями COVID-19.

 but wastewater shows outbreakDecember 2020Alpha varianttakes overJune-July 2021Nightlife reopens, causing spike in cas

Метод проб и ошибок помог ученым и техникам усовершенствовать свои методы во время пандемии. Несколько групп протестировали лучший способ концентрировать образцы, сравнивая, например, время центрифуги и методы фильтрации; они также идентифицировали эталонные вирусы, распространенные в сточных водах, которые могут помочь откалибровать образцы. Одна маловероятно звучащая, но популярная ссылка-это вирус мягкой пятнистости перца (PMMoV). Безвредный для человека, он атакует острый и сладкий перец и повсеместно встречается в сточных водах, проходя через пищеварительную систему, когда мы едим зараженные продукты. Поскольку концентрация в человеческих фекалиях остается относительно стабильной круглый год, ученые используют ее в качестве прокси для количества фекалий в образце, сообщая о результатах как о соотношении уровней PMMoV к уровням SARS-CoV-2.

В Швеции Зейнеп Цетециоглу Гурол и ее коллеги из Королевского технологического института KTH обнаружили, что замораживание образцов, необходимое на некоторое время, поскольку реагенты для ПЦР были в дефиците, привело к резкому снижению уровня вируса. В Канзас-Сити, штат Миссури, исследователи были озадачены тем, что уровень вируса в сточных водах, по-видимому, увеличился в регионе, где клинические случаи казались стабильными. Они обнаружили, что ремонтные работы отвлекли миллионы литров дополнительных сточных вод в канализацию из отдаленных пригородов, исказив их расчеты.

Анджела Чаудхури, эксперт по общественному здравоохранению в Swasti Health Catalyst, которая помогала координировать проект мониторинга Бангалора, говорит, что ее команда должна была выяснить, как уровни в открытых дренажных системах, распространенных в Бангалоре, сравниваются с закрытыми канализациями.

Все чаще ученые делают свои результаты доступными непосредственно для общественности. Например, у проекта Bengaluru была онлайн-панель мониторинга с мая 2021 года это показывает, где уровни вируса увеличиваются, уменьшаются или остаются стабильными. “Существует недоверие к правительству, когда дело доходит до COVID”, - говорит Чаудхури. “Люди думают, что они могут скрывать случаи. Эта панель дает независимый сигнал”, который может подтвердить официальные цифры. Марк Джонсон, вирусолог из Университета Миссури, Колумбия, который помог возглавить обширный мониторинг сточных вод штата, говорит, что СМИ и общественность приветствовали эти данные. Когда приборная панель не могла быть обновлена в канун Рождества, говорит он, команда поговорила с журналистами, жаждущими информации о появлении варианта Omicron в канализационных коллекторах. “Это дает людям душевное спокойствие. Если вы чувствуете, что знаете, что происходит, у вас больше контроля”, - говорит Джонсон.

В дополнение к отслеживанию распространения вариантов, мониторинг сточных вод также позволил Джонсону и другим обнаружить странные штаммы SARS-CoV-2 в Сент-Луисе и Нью-Йорке, которые никогда не наблюдались у пациентов, которые представляют эпидемиологическую и эволюционную тайну (см. Боковую панель ниже).

УЧЕНЫЕ ГОВОРЯТ, ВОЗМОЖНО самый ясный случай мониторинга сточных вод-в местах, где вообще мало вируса. Австралия и Новая Зеландия, например, использовали мониторинг сточных вод в качестве ключевой части своей стратегии zero COVID: как только появился положительный образец, чиновники здравоохранения усилили тестирование, предупредили общественность и, если активные случаи были подтверждены, быстро ввели ограничения, чтобы пресечь вспышку в зародыше. (Хотя мониторинг продолжается, обе страны недавно отказались от нулевого COVID.) Аналогичный подход работал и в небольших масштабах: осенью 2020 года тестирование сточных вод в США кампусы колледжей выявили инфекции в общежитиях до того, как кто-либо дал положительный результат. Тестирование всех жителей позволило органам здравоохранения идентифицировать инфицированного человека до распространения вируса.

Но в регионах, где случаи высоки и распространены индивидуальные тесты, сточные воды могут не добавить существенной информации. “Если у вас ограниченные ресурсы, важно подумать о том, где их лучше всего развернуть”, - говорит Саффорд. Если сточные воды просто подтверждают тенденции, уже наблюдаемые в клинических испытаниях, говорит она, это может быть не лучшая инвестиция.

Каракас, Венесуэла, участвовал в международной пилотной программе мониторинга SARS-CoV-2 в сточных водах.SEVENTOV/ALAMY СТОКОВЫЕ ФОТОГРАФИИ

А в некоторых случаях политики просто не очень заинтересованы. В декабре 2021 года анализ сточных вод в округе Ориндж во Флориде—доме Уолта Диснея—показал, что Омикрон, еще не обнаруженный у пациентов, уже был доминирующим вирусом. Это означало, что приближался огромный всплеск случаев, но политика Флориды означала, что находка мало что изменила в политике общественного здравоохранения.

ОДНАКО НА ДРУГОЙ СТОРОНЕ волны Омикрона сточные воды дали уверенность в том, что снижение, наблюдаемое в проверенных случаях, является реальным, а не просто артефактом максимальной мощности тестирования или сниженной готовности людей пройти тестирование. И по мере того, как пандемия начинает отходить на задний план во многих местах, роль данных мониторинга сточных вод, вероятно, будет расти.

Чтобы сделать данные максимально надежными, исследователи продолжают совершенствовать и стандартизировать свои методы. Особенно перспективными, говорит Гертьян Медема, эксперт по патогенам в сточных водах в Исследовательском институте KWR Water в Нидерландах, являются новые устройства для сбора, состоящие из контейнера с магнитными шариками или хлопчатобумажными “тампонами” для улавливания вируса. Устройство погружено в канализацию и может собирать образец в течение нескольких часов или дней, помогая устранить некоторые нерегулярные колебания концентрации вируса, которые могут возникнуть в результате простого погружения бутылки в воду один раз в неделю. В конечном счете, говорит Гавлик, исследователи хотели бы сойтись на стандартном протоколе сбора и анализа.

Стандартизация также может принести пользу эпиднадзору за другими патогенами. Скрининг на полиовирус проводится во многих странах на протяжении десятилетий, и несколько регионов следят за незаконными наркотиками в сточных водах, но пандемия повысила интерес к поиску других заболеваний. В Бангалоре, отмечает Чаудхури, диарейные заболевания являются основными убийцами. Мониторинг сточных вод может позволить органам здравоохранения выявлять вспышки на ранней стадии и помогать выявлять патогены на работе. Другие исследователи добавляют тесты, чтобы следить за гриппом, ротавирусом, норовирусом, аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом и устойчивыми к антибиотикам бактериями.

Исследователи также хотели бы упорядочить больше вирусов, которые они ловят, потому что стандартные анализы ПЦР обычно не могут различать варианты. Например, программа Нью-Йорка обнаружила Омикрон в образцах, взятых 21 ноября 2021года, за несколько дней до того, как ученые в Южной Африке и Ботсване объявили, что определили вариант. Но команда Нью—Йорка не узнала свою находку до тех пор, пока неделю спустя, после того как они секвенировали образец-и знали, что искать.

Секвенирование образцов сточных вод является проблемой, потому что вирусные частицы обычно деградируют, и они могут поступать из сотен или тысяч источников, говорит Джонсон: “Вы не можете понять, какие из них подходят друг другу” в целом геноме. И из—за того, как работает программное обеспечение для секвенирования, наиболее интересные части генома-регионы, которые меняются чаще всего—можно легко пропустить.

Один из способов обойти это-адаптировать процесс секвенирования для захвата этих быстро меняющихся регионов. Вот как команда Джонсона и еще одна в Нью-Йорке идентифицировали таинственные штаммы: они разработали праймеры секвенирования, чтобы соответствовать началу и концу вирусного гена, который кодирует рецептор-связывающий домен (RBD), часть вируса, которая помогает ему фиксироваться и заражать клетки. Техника выуживает эти последовательности RBD из генетического супа, позволяя исследователям идентифицировать уникальные образцы мутаций, которые могут дать представление о том, как вирус продолжает развиваться.

Возможны новые сюрпризы. Например, вариант Omicron, по-видимому, приводит к гораздо меньшему выделению вируса в фекалиях. Во многих странах, говорит Медема, уровни сточных вод немного отставали от взрыва в случаях. После сравнения результатов исследователи пришли к выводу, что после того, как Omicron вступил во владение, измерения сточных вод недооценивали случаи—возможно, в три или четыре раза. Снижение пролития может быть связано с изменениями в вирусе—или с более высоким уровнем иммунитета у населения, говорит Джонсон.

Число случаев и уровни сточных вод в большинстве стран резко падают в тандеме—по крайней мере, на данный момент. “Мы все чувствуем, что это, наконец, закончилось. Хотя, конечно, это еще не конец, и вирус будет продолжать существовать”, - говорит Медема. “Мы будем продолжать использовать сточные воды в качестве часового, чтобы увидеть, что этот вирус делает с населением.

Отходы, протекающие через столетнюю канализацию Сент-Луиса, дали необычные последовательности SARS-CoV-2.МАРК ПЕТЕРСОН/REDUX

В марте 2021 года команда во главе с вирусологом Марком Джонсоном из Университета Миссури, Колумбия, сделала тревожное открытие в канализации Сент-Луиса: версия SARS-CoV-2, которую никто никогда раньше не видел, с полудюжиной мутаций в белке, который помогает вирусу проникать в клетки. Было неясно, откуда взялся вирус, как он эволюционировал и может ли он вызвать новую волну пандемии. “В тот месяц я мало спал. Я был одержим этим”, - вспоминает Джонсон. “Я не мог понять, что происходит”.

Год спустя Джонсон все еще пытается решить загадку вместе с Джоном Деннехи, экспертом по вирусной эволюции и экологии в Городском университете Нью-Йорка, который обнаружил аналогичные штаммы в сточных водах Нью-Йорка. Теперь они надеются, что образцы РНК из полудюжины стран, отправленные им более чем 30 исследователями после февральского призыва о помощи в Twitter, дадут ответы.

Находка является примером мощности и ограничений мониторинга сточных вод, метода наблюдения SARS-CoV-2, который развивается во всем мире (см. Основную историю выше). В поисках новых вариантов обе команды извлекли и секвенировали РНК, кодирующую рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2, быстро мутирующую часть белка спайка, которая помогает вирусу фиксироваться и заражать клетки. Через несколько недель после своего открытия Джонсон услышал, как Деннехи описал свою находку в вирусологическом подкасте, и связался с ним. “Мы поняли, что мы оба видим странные вещи, и что это, возможно, связано”, - говорит Деннехи.

Необычная последовательность в Сент-Луисе внезапно исчезла из образцов через 6 недель. “Мы никогда не видели этого снова”, - говорит Джонсон. Но последовательности Нью-Йорка, наблюдаемые в трех из 14 основных канализационных коллекторов города, все еще появляются, хотя они до сих пор не были идентифицированы у пациентов-людей. Найти их источник непросто. Вода в канализационных коллекторах содержит фекалии более 4,4 миллиона человек во всех пяти районах Нью-Йорка.

Деннехи и Джонсон обнаружили, что сточные воды также содержат РНК собак, кошек и других животных, всех потенциальных хозяев для варианта. Исследователи исключили трех из них—коров, овец и свиней—в качестве потенциальных хозяев, но Джонсон говорит, что крысы являются вероятным подозреваемым. Тем не менее, в одном из канализационных коллекторов очень мало крысиной РНК с постоянным загадочным штаммом.

“Ничто не имеет смысла” с данными до сих пор, говорит Деннехи. Он считает, что штаммы, скорее всего, исходят от пациентов с ослабленным иммунитетом. “Это могут быть люди, которые хронически инфицированы, которые не могут устранить вирус, но у которых есть какой-то иммунный ответ”, заставляющий вирус развиваться, говорит Деннехи. Джонсон соглашается: “Похоже, что он бежит от иммунной системы”. До сих пор варианты не успешны в распространении; они в основном оставались в водоразделах, где они были обнаружены.

Поскольку мониторинг сточных вод дает только фрагменты вируса, а не полные геномы, выяснить, где загадочные штаммы могут вписаться в эволюционное дерево SARS-CoV-2, сложно. Все они не имеют ключевой мутации, которая появилась летом 2020 года, предполагая, что они произошли от штамма, появившегося в Ухане, Китай, и вызвали первую волну пандемии. Но у них есть генетические изменения во многих из тех же мест, что и вариант Омикрона, что указывает на случай конвергентной эволюции. “Похоже, они подверглись такому же избирательному давлению”, - говорит Деннехи.

Исследователи надеются, что образцы РНК, которые они сейчас получают от коллег, дадут больше подсказок. Уже аналогичные штаммы появились в Калифорнии и Висконсине. “Меня несколько беспокоит, что если мы не сможем определить источник загадочного варианта, то он продолжит развиваться”, - говорит Деннехи. “Если ему удастся приобрести какую—то комбинацию генетических изменений, которая делает его более передаваемым, мы могли бы посмотреть на происхождение Pi” - греческая буква, после которой будет назван следующий повод для беспокойства.